实现完全一次性的单抗生产设施-欧洲杯线上买球

挑战

rentschler biotechnologie gmbh是一家合同开发和制造机构,提供全面的生物制药开发和生产服务。通过后续投资,该公司的生物反应器产量达到2500升,拥有9套先进的gmp生产系统、3套gmp灌装生产线以及600多名受过充分培训的员工。

这些设备已经成功地为许多客户制造了多种重组生物技术蛋白以及抗体产品。但是，rentschler意识到：相比于我们的上游不锈钢和下游混合系统，引入一次性su系统可能会产生重大优势。因此，rentschler启动了一项概念研究,以评估其工艺是否适合改造成全套su系统。此后，该公司制定并执行项目计划，实施一次性上游和下游工艺，用于通用抗体生产。

欧洲杯线上买球的解决方案

rentschler的概念研究侧重于在现有设施内开发两条1,000-l生产线,具有完全一次性的上游和下游单元操作。2010年,作为其发展计划的一部分,该公司成功实施了一次性生物工艺生产线。概念研究确定了“一次性系统优势”框中列出的几个有利的特性。

概念研究表明,用su技术替代不锈钢系统,可以消除不锈钢系统许多固有的限制。结果还表明：这一项目的成功实施需要对现有建筑的一部分进行改造。此外,rentschler的许多客户都指定要采用一次性技术。因此，明显的是：su生产系统应该是rentschler未来业务策略的基本部分。

单抗制造的现有工艺

rentschler的su开发项目基于图1所示的工艺。该工艺的产能≤3,000l,基于一套采用不锈钢和可清洁设备的混合系统,通常用于mab生产,但下游工艺中也有一些su部件。作为一家合同制造商,rentschler需要每条生产线都具有生产多种产品的能力,这就需要经过彻底、全面验证的cip/sip程序。当工艺中使用含有动物成分的培养基时,这对于消除交叉污染并提供专门的生产线而言尤其重要。对超滤(uf)膜包、离子交换层析树脂和病毒过滤器等可重复使用的部件进行反复清洗和再生后,需要对性能和完整性做进一步检查。所有这些和其它因素（如下所述）都是评估su技术的重要动因。

对比研究系统和pq
所有装置运行都考虑采用一次性方案，rentschler可以通过开发改进的su深滤系统避免使用原有装置。我们选择研究200l和1000l生物反应器，对我们的产品组合（30l到250l以及500l到2500l）进行了补充，新设施还可以运行2000l的su生物反应器。本文无法详述关于所有装置运行的所有研究。因此，我们对其中一些只进行总结，其它的则详细介绍，说明各工艺如何使用su系统。

细胞培养：对三家制造商的生物反应器进行初步对比研究后，我们选择了xcellerex xdr生物反应器。该反应器底部装有电磁驱动的三斜叶式叶片、烧结盘或钻孔分布器。在使用限定化学介质进行高密度分批补料（接种细胞浓度>20 × 106/ml）工艺中，使用表达单克隆抗体（mab）的中国仓鼠卵巢（cho）细胞进行研究，结果发现其在细胞活力和浓度、产品生成和质量方面性能表现优异。

在rentschler的生产能力范围内，通过测量生物工艺技术的相关参数集成新系统，例如混合时间、氧气质量传输系数、容积功率输入和传热速率等。总体而言，新设备产生与台式到200l和1000l生物反应器类似的细胞活力和浓度、产品生成以及其它相关代谢参数。

收获和流体澄清

rentschler有关su深滤替代一次性离心分离器的研究已另有详细发表介绍。其结果显示：如果将来自生物反应器中的生物质直接输入深滤器，可以实现低浊度、高产品回收率和良好的吞吐量。使用单级一次性颇尔stax pdk6囊式过滤器产生最高通量和最低成本，其次是0.2μm颇尔supor ekv薄膜囊式过滤器。其它优点包括鲁棒性（无穿孔）和良好扩展性。

rentschler已经完成su深滤器的更多研究，评估过滤前生物质沉降的影响。图3为结果图示。该研究使用2级深滤系统（颇尔stax pdk和pdd囊式），然后是0.2μm颇尔supor ekv褶皱结构膜式过滤器。1000l生物反应器产生的cho细胞生物质被等量分至2个容器中。然后，1批500l直接流经过滤系统，第2批可以在10°c下沉降5小时，然后过滤。

我们监测过滤器上游压力以及流量（通量）和吞吐量（收货重量）。我们还记录了存活细胞数、初始生物质含量、过滤开始和结束时的浊度以及产品效价。当第一深滤器（pdk5）的上游压力达到其1.0巴的最大限值时，达到其过滤器容量。为了最大限度提高产品回收率，我们将50l的磷酸盐缓冲生理盐水（pbs）通过过滤器系统，然后进行空气吹洗，以回收剩余液体。

每次过滤的存活细胞总数为~20 ×106，湿生物质浓度为8%，产品效价为4g/l。

直接生物质过滤的结果如下所示：

• 过滤350kg生物质后，第1深滤器（pdk5）的上游压力稳定上升至最大值1巴。

• 深滤器和膜式过滤器下游压力增加明显较小，表明pdk5过滤器可提供良好的保护作用。

• 收获前的~1,200ntu的生物质浊度在收获后降至可以接受的值11ntu。

• 产品回收率良好，为收获前载量（1,625g）的92%。

结果

沉降后的生物质过滤结果显示与直接过滤数据有明显差别：

• 第一深滤器（pdk5）显示压力出现明显更大的梯度增加，表明生物质的可过滤性增加。

• 吞吐量明显增加，从350kg增加至450kg，尽管pdk5过滤器尺寸从7（m²）下降至5（m²）月牙盘形。这表明过滤器的单位面积容量增加50%，从44l/m增加至>66l/m。

• 收获450kg生物质后，过滤剩余高固沉积物。不出所料，压力增加至1巴限值。然后，我们进行pbs冲洗和使用空气吹洗过滤器，确保良好产品回收率。

• 深滤和膜式过滤器下游的压力特性未发生变化，再次确认pdk5过滤器提供适当的保护作用。收获后浊度值可以接受，为9ntu，产品回收率较高，是收获前加载量（1.915g）的91%。

这些结果表明:如果过滤前让悬浮固体物沉降5个小时，可以明显增加我们前面研究（1）实现的吞吐量。这种附加沉降步骤的好处有2个方面：过滤器尺寸减小从而降低一次性产品成本、提高系统处理能力和将滤材中的产品损失降至最低；以及相同尺寸过滤器的生物质批量增加。

该研究还确认了我们前面的结论，即对于mab生产中的细胞收获，su深滤可以作为机械分离器的切实可行和可靠的替代。影响吞吐量和经济性的主要因素是生物质的数量和性能。继续改进滤材以优化过滤器组可以继续带来吞吐量、过滤器尺寸和扩展性方面带来好处。

离子交换（iex）色谱

此处仅为对iex阶段的概述。.

阳离子交换：对于该装置运行，ge healthcare capto-s树脂iex色谱柱保留作为一次性应用，使用手动填充柱。其床体积为25.5l，床高度和直径为26.5 cm和35cm。色谱柱前后最大允许工作压力为5巴和3巴。我们使用典型的捕获和ph洗脱方案，最高流量达510l/h。洗脱过程中的线性流量从300cm/h下降至100cm/h。我们持续监控紫外线（uv）吸收度、ph和电导率。

阴离子交换：对于该装置运行，我们使用sartorius stedim biotech的sartobind q一次性膜式吸收器囊（5.94m²膜面积、500-l/h f流量）替代层析色谱柱。我们使用相同控制器进行阳离子交换过程。

病毒清除：多年以来，病毒清除用膜式过滤一直是mab工艺的一部分。中空纤维膜式过滤器用于一次性通过、直接过滤模式，有时称作死端过滤。大空隙体积的高级表面改性亲水性膜和精细的微孔结构确保污垢降至最少并大幅降低高病毒效价。

在本阶段，我们让颇尔生命科学开发为特定目的设计的自动化橇装过滤器用于病毒过滤（图2），其具有以下特性：运行可靠且操作员失误风险最低、精密控制压力和流量等参数、内置完整性测试、灵活用于不同过程和过滤模块。可以安装各种类型的病毒过滤器（例如旭化成公司的planova 20n/15n的膜面积为1-16m²）。使用无菌连接器可以简单、快速和可靠地组装岐管和过滤器组件。使用siemens s7控制系统（win cc可视化），系统还适用于深滤和0.2μm过滤。

超滤（uf）和渗滤（df）：我们工艺中的病毒后阶段需要使用超滤（uf）和渗滤（df）进行抗体净化。然后是最终渗余物浓缩，此后是无菌过滤和散料储存。

我们使用自动化颇尔uf橇装过滤器组合一次性岐管评估三家供应商的uf盒。对于病毒过滤，该装置运行实施自动化，这为保证可靠、精密的过程控制和灵活性提供了一种创新方法，可用于多产品生产。更多细节和试验参数如表1所示。根据我们的对比结果（如上所示），我们选择颇尔滤膜系统进行更详细的研究。有关此类uf系统的其它公开研究还显示其性能适合生物制造中的su应用。

在最终验证研究中，我们评估了2个过滤器面积（0.7m²/1m²和2.5m²/2.8m²），评估其性能和可扩展性。为了计算渗滤和浓缩系数，我们记录了进料、渗余物和渗透物的体积。

在验证研究中，在跨膜压（tmp）和渗余物流量恒定时，渗透物f的流量下降不明显，说明未出现明显的膜结垢。本阶段的总处理时间刚超过3个小时。表2所示结果可以总结如下：该系统可以透过5倍以上的渗滤体积。初始和最终体积-浓缩系数达到11.5和1.7，2个膜面积的结果显示有适当的可扩展性。

无菌过滤和散料储存：

我们的最终工艺阶段使用0.2μm除菌级颇尔supor ekv su囊式过滤器，然后无菌移入软生物容器中。

现有建筑的重建：

rentschler计划建造1000l级别的完全一次性上游和下游工艺，这需要定制生产区。公司对现有建筑进行了重建，如图7所示。主要面积是1000l su生物反应器的2个上游处理（usp）区、病毒前和病毒后下游处理（dsp）区、分离接种区、储存和制备区、在线控制（ipc）实验室（例如po2、pco2、ph、细胞计数、存活能力、钠、钾和葡萄糖等）。

重要考虑包括生产线使用过程中的物流、材料流和灵活性。su零件使我们能够限制材料和人员进入我们的接种无尘室、sup和所有dsp工艺。因此，我们将所有散装缓冲液和介质放置中心供应通道中的生物容器中（彩色长方形）。通过分隔墙中密封的岐管转移（虚线）流体，而不是将散装容器穿过气闸门移入压力控制套件中（如红十字所示）。这简化了流体搬运、减少人员进入无尘室区（和交叉污染的伴随风险），减少对我们采暖、通风和空调（hvac）系统的需求。

时间进度和资本支出

现有建筑需要重建，这对我们的项目时间提出挑战。但生产进度和能力未受到严重影响。设置了严格的资本支出目标。图8为项目阶段和实现的时间进度。从开始到完成（为首个客户首个项目过好准备）的总项目持续时间只有18个月。资本支出也在预算范围内，远低于使用不锈钢建造相同回收系统所需要的投资成本。

供应商参与：本项目成功的另一个关键因素是与一次性设备供应生产商建立了紧密的工作关系。例如，rentschler邀请颇尔生命科学的专家协助设计、开发和认证相关过程，确保系统按照良好工程规范（gep）施工（3）。这种合作方式确保开发最适合我们工艺的系统以及满足该时间表。

工艺优点和剩余挑战
 我们在概念研究中识别的潜在优点在实际中已实现。按定量计算，由于折旧下降、维护减少和固定成本摊薄，制造能力增加20%，固定成本降低40%。能量成本也明显下降。不出所料，原材料成本增加，主要原因是层析介质（~60%）。

rentschler已经实现了其开发和运行两套1000l usp和dsp一次性工艺的初始目标，现在正在解决在更大范围实施的其它挑战，特别是2500l和更大的生产规模。下一阶段将包括若干挑战和限制：

• 细胞收获（生产规模用一次性离心机、大量生物质使用的囊式深滤器）

• 柔性生物容器（在现场进行用前泄漏试验）
• 色谱和正切流动过滤（tff）系统（尺寸和规模试有限）

• 操作一次性材料（手动操作需要严格的标准操作程序、sop和持续操作员培训；另外自动式橇装过滤器会更好，因为材料更坚固，可将损坏风险降至最低）。

• 可过滤物和可抽出物（其它工艺特定数据）

• 传感器和光学探针（更丰富的坚固一次性探针）

概念验证

本项目包括最初概念研究、到设计和开发阶段以至于一次性usp和dsp系统的最终实现。这是生物制造行业中首个以1000l生产规模运营的抗体生产用su工艺。与su系统制造商紧密合作，为系统的设计、开发和验证提供了帮助。usp和dsp运行的性能验证在定制制造套装中成功完成。已实现时间轴进度目标和资本投资。

该创新方法使用自动化橇装过滤器进行病毒过滤和tff，这使得我们能够将su技术引入关键和复杂装置操作，同时保持严格的工艺控制。利用这种创新方法，我们在德国劳普海姆的rentschler生物技术工厂获得设备创新类的ispe 2012年度设备环保奖。rentschler非常自豪能成为这一重要奖项的获得者。

对操作员培训和sop进行特别关注，以成功实施。一次性系统使rentschler能够在使用无尘室和设备时引入灵活方法，提高生产能力和避免需要专用生产特定产线。还明显节约成本和实现其它收益。该项目确认su生产可用于1000升规模的单抗工艺。